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乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测及YMDD变异检测试剂盒(HBV&YMDD)

更新:2013-7-5 16:50:49      点击:
  • 品牌:   夸克
  • 型号:   
产物引见

【药品名称】
乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测及YMDD变异检测试剂盒
【汉语拼音】
yixingganyan bingdu hesuan yingguang dingliangjiance ji YMDD bianyi jiance shijihe
【运用目标和实验道理】
本品系接纳乙型肝炎病毒特异引物,应用核酸扩增、荧光符号探针,联合Taqman MGB单探针手艺,对人血清或血浆中乙型肝炎病毒核酸(HBV DNA)定量检测,同时对YMDD M位点变异停止检测。可用于临床对乙型肝炎的辅佐诊断和抗病毒药物的疗效视察。
【实用仪器】
本试剂盒适用于ABI7000、MJ-II、ABI7900型荧光定量PCR仪及响应软件。
【标本要求】
用一次性的针筒抽取病人静脉血2ml,置于灭菌的一次性非肝素抗凝试管中,与星散出的血清0.2ml送检。血清标本正在2℃~8℃可安排72小时,-70℃可临时生存,标本不宜重复冻融。
【实验要领】
标本、对比品的处置惩罚和加样
血清标本、试剂盒内阳性对比、阴性对比、YVDD对比、YIDD对比各与50μl(冻存血清或对比品运用前正在室温融解,振荡混匀10秒钟),离别到场50μl核酸提取液,振荡10秒,99℃干浴或水浴10分钟,13000rpm离心10分钟,保存上浑备用。处置惩罚后的样品应正在3小时内运用,或正在-20℃~-80℃最长生存1个月(不宜重复冻融)。
HBV DNA尺度品停止10、100、1000倍梯度稀释。
与N×36μl混合液取N×0.4μl酶(Taq+UNG)混匀(N为回响反映管数),3000rpm离心10秒,与36.4μl上述PCR回响反映混合液于恰当容量离心管中,然后将样品、阳性对比、阴性对比、YVDD对比、YIDD对比处置惩罚上清液和梯度稀释的HBV DNA尺度品各4μl离别到场离心管中,立刻停止PCR扩增回响反映。
PCR扩增
离心管置于定量荧光PCR仪上,ABI7000、MJ-II、ABI7900轮回参数设置:
37℃×2min;94℃×2min;再按93℃×15sec→60℃×60sec,轮回40次;荧光检测正在60℃,回响反映系统为40μl。
荧光通道检测挑选:HBV DNA定量检测选用FAM通道,YMDD变异检测选用VIC通道。
将定量尺度品及各稀释度拷贝数浓度输入仪器软件中。
【效果剖析】
质量掌握
停止定量分析,挑选荧光检测形式FAM荧光,基线调解与5-15个轮回的荧光旌旗灯号,阈值设定原则以阈值线恰好凌驾一般阴性对比品的最高点。阴性对比HBV DNA拷贝数应为UNDET;强阳性对比HBV DNA拷贝数应≥1×106copies/ml、临界阳性对比HBV DNA拷贝数5×103copies/ml~5×104copies/ml,尺度曲线相关系数应≤-0.98,不然实验视为无效。停止YMDD变异检测,HBV YMDD强阳性对比正在FAM和VIC通道检测Ct值均应≤38,HBV YVDD血清对比、HBV YIDD血清对比正在FAM通道检测所得Ct值应≤38,正在VIC通道检测为UNDET,不然实验视为无效。
效果判定
凭据事情曲线盘算,仪器主动显现待检样品定量值,仪器显现UNDET示意待检样品为阴性。检测样品中5×102copies/ml≤HBV≤5×108copies/ml,测定效果有用,可间接讲演响应的拷贝数。检测样品中HBV DNA>5×108copies/ml,便可间接讲演为>5×108copies/ml,也可用正常人血清按10倍梯度做响应稀释,使其拷贝数落正在1×105copies/ml~5×108copies/ml范围内再从新测定,测定效果应以稀释倍数停止校准。检测样本中HBV DNA<5×102copies/ml时,拷贝数仅供参考,讲演为小于最低检测限。
待检样品正在FAM和VIC通道检测Ct值≤38,判定待检样品为HBV YMDD野生型。待检样品正在FAM通道检测Ct值≤38,正在VIC通道检测为UNDET,判定待检样品为HBV YMDD变异型。若是检测Ct值正在38~40之间,反复检测一次,若是检测Ct值仍正在38~40之间,则判为阴性。
【对实验效果的注释】
乙型肝炎病毒核酸定量值反应病毒在外周血中的浓度,浓度下则传染性强。乙型肝炎病毒YMDD变异状况取该病毒对药物拉米夫定的耐药性间接有关,发作YMDD变异的病毒对拉米夫定能够存在耐药性,联合临床状况综合判定。
【该实验要领的局限性】
该实验要领仅适用于具有FAM和VIC荧光通道的荧光定量PCR剖析仪,单通道荧光PCR剖析仪只能停止HBV DNA定量检测,不克不及停止YMDD变异剖析。
【产物性能指标】
产物最低检测线5×102copies/ml;线性检测局限5×102copies/ml至5×108copies/ml;经741例临床考证,产物检测HBV YMDD变异效果取核酸序列测定效果同等。
【注意事项】
最先检测前请细致浏览本说明书全文。
1.全部检测历程应严厉分正在三区停止:PCR回响反映系统的配制区;标本处置惩罚、加样区;PCR扩增、荧光检测及效果剖析区。各区运用的仪器、装备、耗材和工作服应自力公用。实行后即请干净工作台,并停止消毒。
2.运用不露荧光物资的一次性手套(常常交换)、一次性公用离心管、自卸式移液器和带滤嘴吸头。
3.试剂预备和标本处置惩罚应运用超净工作台(负压式)或防净化罩,以防备对环境污染。
4.每次实行应设置阴阳性对比品
5.操纵职员应经由专业培训,具有肯定履历和操作技能。
6.操作台、移液器、离心机、PCR扩增仪等仪器设备应常常用10%次氯酸或70%酒精、紫外线灯或臭氧消毒处置惩罚。
7.实行顶用过的吸头、扩增终了的离心管、标本和别的烧毁物品一同灭菌后抛弃于指定所在。
8.试剂运用前应正在室温下充裕熔化并混匀。
9.PCR回响反映混合液应避

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